Fabuła The Callisto Protocol przedstawia nam losy niejakiego Jacoba. Akcja rozgrywa się w 2320 roku. Właśnie wtedy Jacob Lee (bohater) oraz jego partner, Max Barrow, pracują dla UJC i pilotują statek zwany UJC Charon. Ich celem jest przewiezienie jakiegoś niebywale cennego ładunku pomiędzy księżycem zwanym Europa, a więzieniem Black Iron usytuowanym na księżycu Callisto. Ma to być ich ostatnia robota, a po niej mają się udać na emeryturę.

W pewnym momencie na pokład statku wdzierają się terroryści odpowiedzialni za biologiczny atak na Europie. Statek musi awaryjnie lądować na Callisto, Max ginie, a Jacob oraz jedna z terrorystek, Dani, zostają wtrąceni do więzienia przez kapitana Ferrisa. Jacob odzyskuje po jakimś czasie przytomność, a następnie szybko przekonuje się, że w Black Iron dzieje się coś złego. Dziwna zaraza przemieniła więźniów w potwory, a jedynym sposobem na ucieczkę jest współpraca z niejakim Eliasem Porterem. Koleś ma plan.

Jacob i Elias wspólnie walczą o przetrwanie i uwalniają w międzyczasie Dani, która miałaby im pomóc w ucieczce. Dziewczyna się na to nie zgadza, ale nasi bohaterowie mimo wszystko próbują dotrzeć do hangaru i uciec. Po drodze zostają zaatakowani przez kapitana Ferrisa i zostają wyrzuceni na powierzchnię Callisto. Tam Elias niestety ginie ponieważ jego maska trafi szczelność i mężczyzna się dusi. Nagle pojawia się Dani i zgrywa wspomnienia Eliasa. Potem wspólnie z Jacobem postanawia uciec.

Dani i Jacob docierają do lądowiska, na które przywołują statek. Maszyna zostaje niestety przechwycona przez naczelnika więzienia i zestrzelona. Bohaterowie po ogromnej eksplozji znowu zmuszeni są do ucieczki. Tym razem decydują się na bardziej frontalny atak. Postanawiają zabić naczelnika, a w tym celu przedzierają się przez pierwszą kolonię na Callisto, Arcas. To na niej powstało Black Iron. 

W trakcie przemierzania Arcas, Jacob poznaje jego przeszłość. Okazuje się, że jakiś czas temu w kolonii także miała miejsce epidemia, w wyniku której zginęli wszyscy jej mieszkańcy. Bohater znajduje też laboratorium, w którym hodowane są biofagi. Z informacji w laboratorium wynika, że UJC chciało przyspieszyć ewolucję, tworząc ludzi zdolnych do tego, by przeżyć w kosmosie. Wszyscy koloniści niestety przemieniają się w krwiożercze i bezmyślne zombie. Tylko jeden, Subject Zero, w jakiś sposób zachował swoją inteligencję, ale finalnie ginie podczas sterylizacji kolonii.

Niedługo potem Ferris ponownie atakuje naszych bohaterów, a Dani zostaje zainfekowana. Dwójka powraca do Black Iron, a Jacob zostaje znokautowany przez robota i trafia do swojej celi. W ucieczce pomaga mu doktor Caitlyn Mahler. Umawia się ona z bohaterem na spotkanie, twierdząc że ma sposób na ocalenie Dani. Z rozmowy wynika, że naczelnik Cole jest częścią religijnej sekty zwanej Kallipolis, próbującej wcielić w życie plan zwany Callisto Protocol. Jego celem jest przyspieszenie ludzkiej ewolucji. Mahler w tym celu eksperymentuje na więźniach, próbując odtworzyć Subject Zero za pomocą Subject Alpha. Jedynym sposobem na ocalenie Dani, jest wydobycie DNA z Alfy i wstrzyknięcie go do żył Dani.

Podczas rozmowy dowiadujemy się też co nieco na temat Europy. Okazuje się, że rozcieńczona wersja wirusa została przez przypadek wypuszczona na Europie. To właśnie ten wypadek sprawił, że naczelnik postanowił doprowadzić do epidemii w Black Iron. Mahler daje Jacobowi dostęp do wspomnień Dani, a z nich dowiadujemy się, że siostra Dani zginęła podczas epidemii na Europie. Przy okazji Jacob odzyskuje też swoje własne wspomnienia, z których wynika, że wiedział on, iż UJC szmuglowało obce próbki larw, ale ignorował ten fakt, aby otrzymać zapłatę.

Jacob finalnie konfrontuje się z naczelnikiem, a potem walczy z Ferrisem oraz Alfą. Wygrywa, pobiera DNA i wstrzykuje je Dani. Cole włącza wówczas samozniszczenie stacji, a Jacob i Dani zaczynają ucieczkę. Na końcu okazuje się, że jest tylko jedna tratwa ratunkowa, do której Jacob wsadza Dani, a ta ucieka z próbką larwy, mającą być dowodem na to, co zaszło na Callisto. Jacob walczy z potworami, gdy nagle kontaktuje się z nim Mahler, mówiąc mu, że prawdopodobnie ma drogę ucieczki, ale muszą działać wspólnie. Nagle Jacob zostaje zaatakowany przez Ferrisa, a gra dobiega końca.